3D-Druck von Verbundwerkstoffen auf Basis von Cellulose-Nanokristallen zum Aufbau robuster biomimetischer Gerüste für die Knochengewebetechnik

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 21244 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Cellulose-Nanokristalle (CNC) erregen aufgrund ihrer Haltbarkeit, Biokompatibilität, biologischen Abbaubarkeit und hervorragenden mechanischen Eigenschaften zunehmend Aufmerksamkeit in den Bereichen Biomedizin und Gesundheitswesen. Hier haben wir mithilfe der Fused Deposition Modeling-Technologie 3D-Verbundgerüste aus Polymilchsäure (PLA) und CNC hergestellt, die aus Ficus thonningii gewonnen wurden. Rasterelektronenmikroskopie ergab, dass die gedruckten Gerüste miteinander verbundene Poren mit einer geschätzten durchschnittlichen Porengröße von etwa 400 µm aufweisen. Die Einbindung von 3 % (w/w) CNC in den Verbundwerkstoff verbesserte die mechanischen Eigenschaften von PLA (Elastizitätsmodul stieg um etwa 30 %) und die Benetzbarkeit (Wasserkontaktwinkel verringerte sich um etwa 17 %). Der Mineralisierungsprozess gedruckter Gerüste mithilfe simulierter Körperflüssigkeit wurde validiert und die Keimbildung von Hydroxylapatit bestätigt. Darüber hinaus ergaben Zytokompatibilitätstests, dass PLA- und CNC-basierte PLA-Gerüste ungiftig und mit Knochenzellen kompatibel sind. Unser Design, das auf dem schnellen 3D-Druck von PLA/CNC-Verbundwerkstoffen basiert, kombiniert die Fähigkeit, die Architektur zu steuern und verbesserte mechanische und biologische Eigenschaften der Gerüste bereitzustellen, was Perspektiven für Anwendungen im Knochengewebe-Engineering und in der regenerativen Medizin eröffnet.

Die Entwicklung von Materialien für den Knochenbau bleibt aufgrund der Komplexität der natürlichen Knochenstruktur und der biomechanischen Umgebung eine Herausforderung. Um beschädigtes Knochengewebe zu reparieren, werden Autotransplantate aus verschiedenen Knochen entnommen und als Ersatz für fehlende Knochen verwendet. Weniger verfügbare Allotransplantate sind entmutigend1,2,3 und künstliche Verbindungen, die als Implantate verwendet werden, müssen oft nach der Heilung entfernt werden4. In jüngster Zeit sind neue Strategien zur Knochenreparatur entstanden, darunter gerüstgestützte regenerative Medikamente zur Förderung des Knochenwachstums5.

Ein ideales Knochengerüst sollte eine dreidimensionale Matrix sein, die in der Lage ist, die komplexe Zusammensetzung und Struktur des Knochens für die Zellanheftung und -proliferation nachzuahmen6. Daher erfordert es eine hohe Biokompatibilität, biologische Abbaubarkeit, Ungiftigkeit, hervorragende mechanische Eigenschaften und eine geeignete Architektur in Bezug auf Porosität und Porengrößen, um sich in das native Wirtsgewebe zu integrieren7. Die chemische Zusammensetzung und die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Gerüsts, die einen direkten Einfluss auf die mechanische und biologische Leistung8 haben, sind daher wichtige zu untersuchende Parameter.

Synthetische Biopolymere werden aufgrund ihrer Biokompatibilität und ihrer Fähigkeit, die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Gerüsts zu steuern, häufig in der Knochengewebetechnik eingesetzt. Sie bestehen aus aliphatischen Polyestern wie Polyglykolsäure (PGA), Polycaprolacton (PCL) und Polymilchsäure (PLA)9. Leider sind sie ziemlich spröde und verlieren in der Regel durch den schnellen Abbau in vivo an Festigkeit. Darüber hinaus behindert ihre hydrophobe Natur die Anlagerung und Proliferation von Knochenzellen10. Um diese Einschränkungen zu überwinden, können Gerüste auf Basis synthetischer Polymere, nämlich PLA oder PCL, durch den Einbau natürlicher Polymerverstärkungen wie Cellulose11,12,13,14,15, Alginat16, Gelatine17, Chitosan18,19 oder Keratin20, die für ihre interessanten Eigenschaften bekannt sind, verbessert werden.

Zur Entwicklung von Gerüsten für das Hartgewebe-Engineering werden verschiedene Techniken eingesetzt, darunter Lösungsmittelgießen und Partikelauslaugen, Emulsions-Gefriertrocknung, Phasentrennung oder Elektrospinnen21,22,23. Allerdings erlauben sie keine effiziente Kontrolle der Morphologie und Porosität.

Die additive Fertigung hat sich als bevorzugte Technik für die Entwicklung und Herstellung biomimetischer Knochenreparaturmaterialien erwiesen. 3D-gesteuerte Gerüstarchitekturen beeinflussen die mechanischen Eigenschaften sowie die Adhäsion und Proliferation von Knochenzellen erheblich2,24,25,26,27,28. Daher konzentrierten sich verschiedene Arbeiten auf die Entwicklung von 3D-gedruckten Gerüsten unter Verwendung verschiedener Technologien, wie Stereolithographie, 3D-Plotting, selektives Lasersintern, Bioprinting und Fused Deposition Modeling (FDM). FDM ist die am weitesten verbreitete additive Fertigungstechnologie. Es handelt sich um eine einfache und schnelle Technik mit geringen Kosten, die großartige Möglichkeiten für den Umgang mit Polymeren bietet.

Mehrere Studien haben die Verstärkung von PLA mit Nanomaterialien wie Graphenoxid29, Bornitrid (BN)-Nanofüllstoffen21 und Nanohydroxylapatit30,31,32 untersucht, um die mechanischen und bioaktiven Eigenschaften des Polymergerüsts zu verbessern. Cellulose ist ein vielversprechendes Material für biomedizinische Anwendungen, einschließlich Tissue Engineering, Stammzellforschung und regenerative Medizin33,34,35,36,37 aufgrund ihrer hervorragenden Biokompatibilität, günstigen biologischen Abbaubarkeit, guten mechanischen Eigenschaften, hohen spezifischen Oberfläche, geringen Dichte und nicht- abrasiver Natur38,39,40,41. Insbesondere Cellulose-Nanokristalle (CNC) eignen sich wirksam als Verstärkungsmittel oder Nanofüllstoffe im Gerüstdesign und die Ergebnisse bestätigten, dass CNC die mechanische Leistung und Zytokompatibilität von Gerüsten erheblich verbessern38,39,42,43. Darüber hinaus verfügt CNC über viele Hydroxylgruppen, die mit Carbonylgruppen von PLA intermolekulare Wasserstoffbrückenbindungen bilden können, um eine günstige Grenzflächenhaftung zu erreichen. Die Mischung von PLA mit Biopolymeren wie Zellulose verbessert die Eigenschaften von PLA, ohne seine Biokompatibilität zu verändern. PLA/Zellulose-Verbundwerkstoffe wurden in großem Umfang entwickelt und es wurden Studien zu strukturellen, thermischen und mechanischen Eigenschaften durchgeführt12,44,45,46,47,48,49,50,51. Auch wenn in der Literatur über PLA- und Cellulose-Nanokomposite für Anwendungen im Tissue Engineering berichtet wird, glauben wir, dass noch Raum für die Entwicklung von 3D-Gerüsten für das Tissue Engineering mittels FDM besteht, einer schnellen und kostengünstigen additiven Fertigungstechnik, insbesondere zur Überwindung bestimmter Einschränkungen dem PLA begegnet, nämlich der mechanischen Widerstandsfähigkeit des Biopolymers.

Diese Arbeit zielt daher darauf ab, die Wirkung des CNC-Gehalts auf PLA/CNC-Gerüste, die mit FDM verarbeitet werden, und seinen Einfluss auf die endgültigen strukturellen, Oberflächen- und mechanischen Eigenschaften der Biokomposite aufzuklären. Mit dem resultierenden PLA/CNC3 wurden Biomineralisierungs-, In-vitro-Bioabbaubarkeits- und Zytokompatibilitätstests durchgeführt (d. h. mit 3 % (w/w) CNC, das in den Verbundstoff eingearbeitet wurde). Das resultierende Material ist ein mechanisch verbessertes Gerüst, das große Möglichkeiten für den Entwurf und die schnelle Herstellung biomimetischer 3D-Gerüste mit geeigneten biologischen Eigenschaften bietet.

Die in Abb. 1 dargestellten Rasterelektronenmikroskopiebilder (REM) zeigen deutlich reine PLA-Filamente mit einer glatten und regelmäßigen Oberfläche, während die der Verbundstoffe aufgrund der Bildung von Aggregaten im Zusammenhang mit dem Vorhandensein von CNC rau sind. Tatsächlich könnte die Entwicklung der PLA-Oberfläche nach dem Einbau von CNC von einem glatten Zustand zu einem rauen Zustand auf eine gute CNC-Dispersion über die gesamte PLA-Oberfläche hindeuten. Der Einbau von mehr als 3 % (w/w) CNC führt zur Bildung großer Partikel, was zu weniger Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der Matrix (PLA) und der Verstärkung (CNC) führen könnte. Tatsächlich ist die Dispersion von CNC in PLA aufgrund der hydrophilen Natur von Cellulose im Vergleich zur hydrophoben Natur von PLA gering, was ihre Wechselwirkung und gleichmäßige Dispersion schwierig macht52.

REM-Bilder von extrudierten PLA- und PLA/CNCx-Verbundfilamenten.

Die aus der Hybridisierung von PLA resultierenden Verbundfilamente weisen gute Kapazitäten zur Verbesserung der Zellbindung und -proliferation auf. In dieser Hinsicht sind PLA/CNC-Verbundwerkstoffe gute Kandidaten für biomedizinische Anwendungen, insbesondere bei der Knochenregeneration. Tatsächlich könnten Zellulosefüllstoffe (CNC) wichtige Zellanlagerungs- und Proliferationsstellen für jedes implantierbare Gerüstmaterial in der Hartgewebetechnik schaffen. Es wurden bereits mehrere Studien durchgeführt, um PLA/CNC-Verbundfilamente durch Einschneckenextrusion zu entwickeln, die mit FDM52,53,54 bedruckt werden können. Die Entwicklung von PLA/CNC-Filamenten zur Herstellung von Hybridgerüsten für biomedizinische Anwendungen bleibt unseres Wissens jedoch neu.

Die Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR)-Analyse der Filamente ist in Abbildung S1 in den Zusatzinformationen dargestellt. Unsere Ergebnisse zeigen einen leichten Anstieg der Spitzenintensitäten mit zunehmender CNC-Beladung innerhalb der PLA-Matrix, was mit der Literatur übereinstimmt52. Die signifikantesten Unterschiede wurden bei 2946, 1743 und zwischen 1500 und 1000 cm−1 beobachtet, die jeweils auf die Streckung von CH, C=O-Bindungen, Carbonyl-Streckschwingung (C=O) und auf CO von PLA55 zurückzuführen sind.

Die Zersetzung von CNC-, PLA-Filamenten und den daraus abgeleiteten Verbundwerkstoffen wurde anhand der in Abb. 2 dargestellten Kurven der thermogravimetrischen Analyse (TGA), der abgeleiteten Thermogravimetrie (DTG) und der Differentialscanningkalorimetrie (DSC) untersucht. Ein leichter Gewichtsverlust wird zwischen 100 und etwa 100 % beobachtet 325 °C in allen Proben aufgrund der Dehydrierung der Filamente und der Depolymerisation von PLA sowie des Aufbrechens glykosidischer Bindungen in Cellulose. Im Vergleich zu PLA weisen die Verbundwerkstoffe aufgrund der hygroskopischen Natur der Verbundwerkstoffe nach dem Einbau von hydrophilem CNC einen höheren Gewichtsverlust auf. Daher geben Verbundwerkstoffe bei thermischer Belastung die aufgenommene Feuchtigkeit ab, was zu diesem relativ hohen Gewichtsverlust führt. Darüber hinaus kommt es bei 400 °C zu einem starken Gewichtsverlust, der wahrscheinlich mit der Zersetzung von PLA und CNC zusammenhängt. Die beginnenden Zersetzungstemperaturen von CNC und den Filamenten werden bei 225, 318,8, 311,8, 325,5 und 320,4 °C für CNC, PLA, PLA/CNC1, PLA/CNC3 bzw. PLA/CNC5 beobachtet. Die entwickelten Filamente können daher bei Temperaturen von bis zu 300 °C verarbeitet werden, ohne dass sie beschädigt werden. Daher scheint die in unserer Studie verwendete Drucktemperatur von 200 °C optimal für die Entwicklung von PLA/CNC-Gerüsten zu sein. Allerdings verbessert CNC die thermische Stabilität von PLA nicht wesentlich. Darüber hinaus zeigen die DTG-Kurven einen Rückgang der maximalen Degradationstemperatur der Verbundwerkstoffe im Vergleich zu reinem PLA. Der maximale Abbau von PLA/CNC3 erfolgt über einen Temperaturbereich (T) von etwa 365–374 °C, während der von PLA, PLA/CNC1 und PLA/CNC5 bei T = 373,39, 370,62 bzw. 369,22 °C auftritt. Tatsächlich kann die relativ große Abbautemperatur von PLA/CNC3 auf die bessere Hybridisierung des Verbundwerkstoffs zurückgeführt werden, die sich in einer besseren Wechselwirkung zwischen 3 % von CNC und PLA widerspiegelt.

Thermoanalyse von extrudierten PLA- und PLA/CNCx-Filamenten. (a) thermogravimetrische Analyse (TGA, unter Stickstoff von Raumtemperatur bis 800 °C bei einer Heizrate von 10 °C min−1), (b) abgeleitete TGA (DTG) und (c) Differentialscanningkalorimetrie (DSC-Kurven, aus Raumtemperatur bis 250 °C mit einer Heizrate von 20 °C min−1 unter Stickstoffatmosphäre) zeigt die Tg, Tcc und Tm von PLA und den Nanokompositen.

Darüber hinaus zeigt die Analyse der DSC-Kurven (Abb. 2c) aller Proben nacheinander endotherme Zustandsänderungen (Glasübergang), gefolgt von einem exothermen Peak für die Kaltkristallisation und einem endothermen Peak aufgrund der Fusion. Im Vergleich zu PLA zeigen die Verbundfilamente eine Verschiebung des Glasübergangs, der Kaltkristallisation und der Schmelzpeaks hin zu niedrigsten Temperaturen. Dies deutet darauf hin, dass die CNC dazu neigt, die Zustandsänderungstemperaturen von PLA zu senken (Tabelle 1). Tatsächlich erweitert sich der Glasübergangsbereich mit zunehmender CNC-Belastung. Dies deutet darauf hin, dass die Zugabe von Cellulose die Kristallinität aufgrund der erhöhten Mobilität der PLA-Ketten erhöht56. Dies steht im Einklang mit den in Tabelle 1 dargestellten Berechnungen des Kristallinitätsgrads. Die Zugabe von 3 % (Gew./Gew.) CNC zur PLA-Matrix führte zu einem breiteren Glasübergangsbereich mit einem schwächeren Peak, was auf eine bessere Wechselwirkung zwischen CNC und PLA hinweist und könnte daher eine gute Dispersion und gute Grenzflächenhaftung widerspiegeln.

In den Zusatzinformationen zeigen die Abbildungen S2 und S3 die thermische Analyse von CNC und von 3D-gedrucktem PLA bzw. PLA/CNC3, was beweist, dass PLA beim Drucken keine thermische Abbaubarkeit aufweist.

Implantierbare Gerüste für biomedizinische Anwendungen erfordern spezifische Eigenschaften, um die Funktionen nativer Organe optimal zu erfüllen und die Regeneration von beschädigtem Gewebe zu unterstützen. Unter ihren Eigenschaften bleiben die mechanischen Eigenschaften die wichtigsten, um den Regenerationsprozess zu unterstützen. Mehrere Autoren haben Gerüste untersucht, die verschiedene Materialien kombinieren, um eine erfolgreiche Substitution oder mechanische Unterstützung bereitzustellen, die zur Förderung des neuen Gewebewachstums an Defektstellen erforderlich ist. Allerdings hängen die mechanischen Eigenschaften von Hybridgerüsten von der Herstellungsmethode, dem Inhalt, der Ausrichtung der Nanomaterialien, der Art der Matrix, den Wechselwirkungen zwischen der Polymermatrix und den Nanomaterialien usw. ab21,29,57,58,59, 60.

Für den 3D-Druck von PLA/CNC-Gerüsten mittels FDM wurden verschiedene Filamentzusammensetzungen verwendet, wie im experimentellen Teil beschrieben. Die Analyse der Wirkung von Cellulose auf den Elastizitätsmodul, die Elastizitätsgrenze und die Bruchdehnung der 3D-gedruckten Gerüste wurde untersucht und die Ergebnisse sind in Abb. 3 dargestellt. PLA-Gerüste haben einen durchschnittlichen Elastizitätsmodul von 2,4 ± 0,1 GPa gemäß Literatur29,61 und eine durchschnittliche Bruchdehnung von 2,4 ± 0,3 %, während der durchschnittliche Elastizitätsmodul und die Bruchdehnung der Verbundwerkstoffe zwischen 2–3 GPa bzw. 2–3,6 % liegen. Dies steht in guter Übereinstimmung mit den Eigenschaften von PLA/Naturfaser-Verbundwerkstoffen62. Es scheint, dass die Zugabe von 3 % CNC die mechanische Festigkeit von PLA erhöht (p ˂ 0,001). Diese Verbesserung ist möglicherweise auf eine bessere Hybridisierung von CNC-Partikeln in PLA-Ketten zurückzuführen, um die beste Kompatibilität zu gewährleisten und jegliche externe Belastung zu absorbieren. Tatsächlich sorgen die molekularen Wechselwirkungen zwischen PLA und CNC bei einer relativ geringen Konzentration an Zelluloseverstärkung für eine gute Steifigkeit der Verbundwerkstoffe. Dies führt zu einer Verbesserung des Elastizitätsmoduls63 von 2,4 ± 0,1 GPa für PLA auf 3,1 ± 0,2 GPa für PLA/CNC3, da die Partikel bei niedrigen CNC-Konzentrationen dazu neigen, sich in Richtung der Orientierung der PLA-Ketten auszurichten52. Dadurch wird die angelegte Spannung innerhalb der Verbundstruktur von einer Fibrille auf die nächste übertragen und ermöglicht so eine gleichmäßige Spannungsverteilung im Material. Die Verbesserung der Bruchdehnung und der Verformungskräfte beim Bruch der Verbundwerkstoffe mit Zelluloseverstärkung ≤ 3 % lässt darauf schließen, dass das Vorhandensein von CNC tendenziell die Elastoplastizität von PLA verbessert. Dies könnte auf die gute Faser-Matrix-Interaktion aufgrund einer besseren Verzahnung des CNC-Netzwerks in der PLA-Matrix zurückzuführen sein. Der Einbau von 5 % CNC neigt dazu, große, im Verbundwerkstoff verteilte Partikel zu bilden, was zur Bildung weniger Bindungen zwischen der Matrix (PLA) und der Verstärkung (CNC) und einer schlechten Kompatibilität führt, was zu einer schlechten mechanischen Leistung führt.

Mechanische Eigenschaften: (a) Foto von hundeknochenförmigen PLA- und PLA/CNCx-Gerüsten für Zugfestigkeitstests. (b) Elastizitätsmodul. (c) Zugelastizitätsgrenze. (d&e) Bruchspannung (***p ˂ 0,001, ** p < 0,01, ns = nicht signifikant).

Basierend auf diesen Ergebnissen haben wir uns bei den folgenden Analysen ausschließlich auf PLA/CNC3 konzentriert. Wenn der CNC-Gehalt tatsächlich mehr als 3 % (Gew./Gew.) beträgt, kann das PLA die Oberfläche des CNC nicht ausreichend benetzen, was zu einer starken Faser-Faser-Wechselwirkung und/oder Faseragglomeration in der PLA-Matrix führt52,54. Allerdings fanden Kumar et al.52 einen Anstieg des Elastizitätsmoduls (E) um 50 % mit 1 % CNC (4550 MPa) im Vergleich zu reinem PLA (3030 MPa). Der Elastizitätsmodul von PLA und seinen Verbundwerkstoffen war besser als unserer. Dennoch ist bei 1 % CNC (2,8 %) im Vergleich zur reinen PLA-Probe (8,7 %) eine Abnahme der Bruchdehnung zu beobachten.

Die Oberflächenmorphologie von PLA- und PLA/CNC3-Gerüsten wurde mittels REM, optischer 3D-Mikroskopie und Topographie analysiert (Abb. 4). Diese Bilder zeigen deutlich, dass das PLA-Gerüst eine glatte Oberfläche hat, während das von PLA/CNC3 aufgrund der Anwesenheit von Zellulose rau ist. Idealerweise sollten die gedruckten Gerüste gleich große Poren aufweisen. Die Analyse von SEM-Bildern (Abb. 4) zeigt jedoch, dass die Porengröße des Hybridgerüsts (PLA/CNC3) zunahm, während die Breite der Stäbchen abnahm, ähnlich wie in der Literatur berichtet21,29. In unserer Arbeit werden die durchschnittliche Porengröße und die Stabbreite von PLA- und PLA/CNC3-Gerüsten mit (362 ± 19 µm und 458 ± 17 µm) bzw. (450 ± 15 µm und 337 ± 30 µm) bewertet. Diese Variation in der Morphologie der Gerüstoberfläche kann auf die Veränderung des rheologischen Verhaltens der Matrix durch die Zugabe von CNC zurückgeführt werden. Tatsächlich könnte die Zugabe von CNC das elastische Verhalten von PLA einschränken und ihm daher Stabilität verleihen, damit es während der Abscheidung seine Form behält. Allerdings führt die Verstärkung zu einer Instabilität des Materialflusses während des Druckens, was sich wahrscheinlich auf die Qualität und Auflösung auswirkt.

Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von 3D-gedruckten Gerüsten: Draufsicht auf die Morphologie von (a) PLA und (c) PLA/CNC3. Querschnitt mit vergrößertem Einschub von (b) PLA und (d) PLA/CNC3. (g) Statistische Analyse der 3D-gedruckten PLA- und PLA/CNC-Durchmesser, die mittels REM auf den Proben beobachtet wurden (Test Anova, **p < 0,01). Topographie von 3D-gedruckten Gerüsten, die typischerweise die Oberflächenrauheit von (e) PLA und (f) PLA/CNC3 zeigt.

Darüber hinaus ist die Porosität einer der kritischsten Parameter zur Bewertung der Effizienz und Anwendbarkeit biomedizinischer Gerüste, insbesondere beim Knochengewebe-Engineering, der Arzneimittelabgabe usw. Eine hohe Porosität fördert die effiziente Freisetzung von Biofaktoren, einschließlich Zellen, Genen und Proteinen, und sorgt für eine Umgebung fördert den Nährstoffaustausch64,65. Die Porosität von PLA- und PLA/CNC3-Gerüsten ist relativ hoch (58 ± 2 % bzw. 67 ± 2 %). Die Zugabe von 3 % CNC erhöht die Porosität von PLA-Gerüsten (**p ˂ 0,01), was auf die ionische Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Komponenten zurückzuführen ist, die zu mehr Hohlräumen in den Gerüsten führt. Mit solchen Porositätsprofilen könnten gedruckte Gerüste dazu beitragen, das Knocheneinwachsen zu verbessern, indem sie eine optimale Vaskularisierung, Hydroxylapatit-Keimbildung und Mineralreifung ermöglichen66,67.

Hydrophilie ist eine Eigenschaft, die die Adhäsion, Zellproliferation und Rehydrierungskapazität von Gerüsten erheblich beeinflusst; Daher scheint es für die Leistung von Gerüsten für jede Anwendung im Tissue Engineering, einschließlich der Knochenregeneration, von entscheidender Bedeutung zu sein. So konnten die Reaktivität und Wechselwirkung zwischen den gedruckten Gerüsten und der umgebenden Oberfläche durch Messung des Kontaktwinkels und Untersuchung der Quellung in Wasser vorhergesagt werden. Abbildung S4 (siehe ergänzende Informationen) zeigt die Wasserkontaktwinkel von PLA- und PLA/CNC3-Gerüsten. Die Werte sind in Tabelle 2 dargestellt. CNC verleiht der hydrophoben Oberfläche von PLA-Gerüsten aufgrund der Neuanordnung von CNC in der PLA-Matrix einen hydrophilen Charakter . Um die Wirkung von Zellulosefüllstoff auf die Hydrophilie von PLA besser zu verstehen, haben wir die Wasseraufnahmerate von Gerüsten bewertet (Tabelle 2). Die Zugabe von CNC führt entsprechend den Ergebnissen des Kontaktwinkels und der Oberflächenrauheit der Gerüste zu einer Verbesserung der Wasseraufnahme von PLA. Ähnliche Ergebnisse zur Wasserretention wurden von Murphy et al.56 bei PLA- und PLA/Zellulose-Filamenten beobachtet. Sie zeigten einen signifikanten Anstieg der Wasseraufnahme während der ersten 24 Stunden, gefolgt von einer Stabilisierung bis hin zum allmählichen Erreichen eines Plateaus (1,2 % für das PLA-Filament und 1,4 % für das PLA/Zellulose-Verbundfilament).

Angesichts dieser Ergebnisse sind PLA/CNC-Gerüste in der Lage, eine für die Zellproliferation günstige Umgebung zu schaffen und erscheinen daher als Verbundwerkstoffe der Wahl für die Knochenregeneration.

Der enzymatische Abbau biomedizinischer Gerüste wird routinemäßig durch die Bestimmung des Gewichtsverlusts untersucht. In unserer Studie wurden PLA- und PLA/CNC3-Gerüste einer In-vitro-Abbaustudie unterzogen, indem sie über einen Zeitraum von 28 Tagen in Alcalase-Puffer getaucht wurden. Den in Abb. 5 dargestellten Ergebnissen zufolge scheint es, dass das PLA-Gerüst im Vergleich zum PLA/CNC3-Verbundwerkstoff einen langsameren Abbau aufweist. Tatsächlich wurden für PLA und PLA/CNC3 Abbauraten von 1,7 ± 0,3 % bzw. 3,9 ± 0,1 % nach 28-tägigem Eintauchen in den Alcalase-Puffer ermittelt. Sie gelten daher als stabil. Der Einbau von CNC in die PLA-Matrix verbessert relativ den Abbau von PLA. Im Vergleich zu Studien von Belaid et al.29 zu PLA- und Graphenoxid (PLA/GO)-Verbundgerüsten führt die CNC-Beladung zu einer moderaten Verbesserung der Abbaurate von PLA-Gerüsten im Alkalasepuffer. Somit erscheint CNC als geeignete Verstärkung von PLA. Daher kann PLA/CNC-Biokomposit als potenzielles Material für die Entwicklung von Gerüsten konzipiert werden, die als temporärer Ersatz, insbesondere für die Regeneration von Knochengewebe, verwendet werden können. PLA/CNC-Verbundwerkstoffe könnten günstige Übergangseigenschaften aufweisen, indem sie im Laufe der Zeit resorbieren, um Platz für neu gewachsenes Knochengewebe zu schaffen, das das Gerüst im Körper ersetzen wird.

Gewichtsverlust von PLA- und PLA/CNC3-Gerüsten als Funktion der Abbauzeit (Gerüste über einen Zeitraum von 28 Tagen in Alcalase-Puffer eingetaucht). (**p ˂ 0,01 und ***p ˂ 0,001 unter Verwendung einer ungepaarten t-Test-Analyse).

Der biomimetische Mineralisierungsprozess gedruckter Gerüste in SBF wurde ausgewählt, um die Bildung von Apatit auf der Oberfläche von PLA und PLA/CNC3 zu bewerten und Rückschlüsse auf deren Knochenregeneration und Bindungskapazität zu ziehen. Abbildung 6 zeigt REM-Bilder der Oberfläche von PLA- und PLA/CNC3-Gerüsten nach 14 Tagen Inkubation in der SBF-Lösung. Der Prozess des Mineralwachstums auf der Oberfläche der Gerüste wurde durch die Bildung einer bioaktiven Beschichtung erfolgreich erreicht. Bei allen Proben ist deutlich die Bildung einer inhomogenen Mineralschicht zu beobachten, die sich in der unregelmäßigen Verteilung von Nanokristallaggregaten auf der Oberfläche widerspiegelt, deren Größe und Dichte von der Inkubationszeit und der Zusammensetzung des Gerüsts abhängen. Mehrere Autoren haben ähnliche Ergebnisse beobachtet68,69,70,71,72,73. Die keimhaltigen Mineralpartikel auf der Oberfläche der Gerüste haben ein stäbchenförmiges Aussehen. Die Mineralisierung von Apatitkristallen hängt vom pH-Wert des Mediums, der Adsorption und Freisetzung von Ionen an der Grenzfläche und der Oberflächenbenetzbarkeit71 ab. Insgesamt nimmt die Mineralisierung mit der Inkubationszeit zu und ist bei PLA/CNC3-Gerüsten größer und schneller. Tatsächlich erfolgt die Ablagerung von Apatit auf der Oberfläche von PLA aufgrund seiner langsamen Hydrolyse in SBF-Lösung69 relativ langsam. Die Hydrolyse von PLA in SBF-Lösung kann mehrere Wochen dauern, bis sich auf seiner Oberfläche neue Carboxyl- (–COOH) und Hydroxylgruppen (–OH) bilden. Dann unterliegen die Carboxylgruppen einer teilweisen Dissoziation unter Bildung von Carboxylat-Ionen (COO−) auf der Oberfläche, die ihre negative Ladung verursachen. Die starke elektrostatische Wechselwirkung zwischen COO−- und Ca2+-Ionen sowie die starken Wasserstoffbrücken zwischen Carboxylgruppen und PO43−-Ionen treiben dann den Prozess der Akkumulation von Calcium-Ca2+- und Phosphationen PO43−69,74 voran.

Bewertung des Apatitwachstums auf in SBF mineralisierten PLA- und PLA/CNC3-Gerüsten nach 14 Tagen durch Rasterelektronenmikroskopie bei hoher und niedriger Vergrößerung (REM), um die Bildung der anorganischen Schicht zu validieren, und durch Elementkartierung, um das Vorhandensein und die homogene Verteilung von zu zeigen die Elemente Phosphat und Kalzium, aus denen der Apatit besteht. (a) REM-Bilder und elementare Kartierung von PLA, (b) REM-Bilder und elementare Kartierung von PLA/CNC3.

Andererseits könnten wir spekulieren, dass die Zugabe von CNC zur PLA-Matrix den Prozess der Mineralschichtbildung aufgrund der Hydrophilie, die aus der Bildung zusätzlicher Hydroxylgruppen auf der PLA-Oberfläche resultiert, verändern könnte. Diese funktionellen Gruppen spielen eine wichtige Rolle beim Ionenaustausch zwischen der Oberfläche und der umgebenden Flüssigkeit und bei der Ablagerung von Apatit auf dem Gerüst. Tatsächlich bringen diese Hydroxidgruppen zusätzliche negative Ladungen auf die Oberfläche des Gerüsts, um mit den Ca2+- und PO43−-Ionen des SBF zu interagieren und so die Adsorption und Keimbildung von Apatit zu fördern68,71,75,76. Angesichts dieser Ergebnisse sind PLA/CNC-Verbundwerkstoffe gute Kandidaten zur Unterstützung der Apatitbildung und tragen daher zur Knochenregeneration und -bindung bei, indem sie eine geeignete Mikroumgebung für Zellwachstum und Reparaturfunktion bieten.

Die Biokompatibilität des PLA/CNC-Gerüsts wurde mit menschlichen hFOB1.19-Osteoblasten77 untersucht. Im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen (Ctrl) zeigte die Inkubation mit PLA und PLA/CNC3-Filamenten keine hemmende Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen am Tag 5 (Abb. 7a), was bestätigt, dass PLA und CNC zytokompatibel sind.

Zytokompatibilität von PLA- und PLA/CNC-Filamenten und -Gerüsten. (a) Wirkung von PLA oder PLA/CNC3-Filamenten auf die Lebensfähigkeit menschlicher hFOB-Osteoblasten am Tag 5 der Kultur. (b) Rasterelektronenmikroskopie, die hFOB-Zellen zeigt, die auf den Gerüsten PLA (linkes Feld) und PLA/CNC3 (rechtes Feld) gewachsen sind (Maßstabsbalken = 200 µm). (c) Wachstum lumineszierender hFOB-Zellen auf den PLA- und PLA/CNC3-Gerüsten an den Tagen 1, 2 und 4. (d) Expression osteogener Differenzierungsmarkergene auf hFOB-Zellen, die 2 Tage lang in Gegenwart von PLA- und PLA/CNC3-Eluaten gezüchtet wurden. Die statistische Analyse wurde mithilfe des Mann-Whitney-Tests zwischen PLA und PLA/CNC3 durchgeführt (ns, nicht signifikant; ***, p < 0,001).

Um festzustellen, ob Knochenzellen in der Lage waren, an den entsprechenden Gerüsten zu haften und sich zu vermehren, führten wir eine Rasterelektronenmikroskopie durch, nachdem wir die hFOB-Zellen auf den Gerüsten ausgesät hatten. Wie in Abb. 7b gezeigt, breiteten sich hFOB-Zellen vollständig auf den PLA- und PLA/CNC3-Gerüsten aus und zeigten eine normale Morphologie. Darüber hinaus haben wir auch biolumineszierende hFOB-Zellen (osteoblastische Zelllinie) auf die Gerüste ausgesät und deren Wachstum im Laufe der Zeit überwacht. Nach 6 Tagen vermehren sich die Osteoblasten auf beiden Gerüsten deutlich und es wurden keine signifikanten Unterschiede auf dem PLA/CNC3-Gerüst im Vergleich zu PLA beobachtet (Abb. 7c). Schließlich bewerten wir die Wirkung von PLA und PLA/CNC3 auf die hFOB-Differenzierung, indem wir mittels RT-QPCR die Expression von Genen (ALP, RUNX2 und OCN) messen, die als Marker der Knochendifferenzierung verwendet werden. Wie in Abb. 7d gezeigt, war das Expressionsniveau der drei Gene in Gegenwart von PLA/CNC3 höher als in Gegenwart von PLA allein. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass PLA/CNC3-Gerüste das Knochenzellwachstum vollständig unterstützen und biokompatibel sind.

Insgesamt stimmt unser Ansatz bei der Entwicklung biomimetischer 3D-Gerüste für die Knochengewebetechnik mit früheren Untersuchungen überein, die zeigen, dass die Verstärkung von PLA mit Nanomaterialien die biologischen und mechanischen Eigenschaften des Materials verbessert21,29. Dennoch sind die vorhandenen Nanofüllstoffe synthetisch und könnten bei einer Anreicherung im Gewebe unerwünschte Wirkungen auslösen. Hier verbessert ein natürliches Biopolymer mit relevanten biologischen Reaktionen, z. B. CNC, das in optimaler Menge in die PLA-Matrix eingebaut wird, die mechanische Festigkeit des Gerüsts erheblich, ohne die einstellbare Porosität und Struktur zu verändern. Dies ist ein Schlüsselparameter, um eine optimale Funktionalität modernster biomimetischer Gewebegerüste zu erreichen.

Mit Cellulose-Nanokristallen verstärkte PLA-Gerüste wurden erfolgreich mithilfe der FDM-Technologie entworfen und hergestellt. Ihre Struktur, Oberfläche, morphologischen und mechanischen Eigenschaften sowie ihre biologische Leistung wurden bewertet. Die 3D-Zellgerüste sind hochporös und weisen offensichtlich eine miteinander verbundene, sich wiederholende poröse Architektur auf, die das Wachstum des Knochengewebes fördert, indem sie eine optimale Vaskularisierung, Hydroxylapatit-Keimbildung und Mineralreifung ermöglicht. Der Einbau von 3 % (w/w) CNC in den Verbundwerkstoff erhöht die mechanischen Eigenschaften von PLA und die Oberflächenrauheit und trägt gleichzeitig zur Verbesserung der Benetzbarkeit durch einen Oberflächenübergang von PLA von hydrophob zu hydrophil bei. Der Mineralisierungsprozess der gedruckten Gerüste mithilfe simulierter Körperflüssigkeit und die Keimbildung von Hydroxylapatit wurden bestätigt. Schließlich schienen PLA/CNC-Verbundwerkstoffe vollständig mit menschlichen Osteoblasten kompatibel zu sein und ermöglichten deren Adhäsion und Proliferation. Unsere Ergebnisse werfen ein Licht auf die Relevanz von CNC in PLA-basierten Verbundwerkstoffen für das Tissue Engineering und eröffnen einfache und vielversprechende Möglichkeiten zur Entwicklung multifunktionaler 3D-gedruckter Gerüste, die für zukünftige Anwendungen zur Geweberegeneration aktiv sind.

Polymilchsäure-Pellets (PLA) wurden von NatureWorks LLC gekauft. Dichlormethan (CH2Cl2, < 99,7 %, CAS 75-09-2, Sigma-Aldrich), Natriumhydroxid (NaOH, Pellets, 98,9 %, Sigma-Aldrich), Schwefelsäure (H2SO4, 95,0–98,0 %, CAS 7664-93- 9, Sigma-Aldrich), Wasserstoffperoxid (H2O2, 30 % (w/w), CAS 7722-84-1, Sigma-Aldrich), Ethanol (96 % vol, CAS 64-17-5, Sigma-Aldrich), Natriumchlorid (NaCl, ≥ 99 %, CAS 7747-14-5, Sigma-Aldrich), Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3, ≥ 99,7 %, CAS 144-55-8, Sigma-Aldrich), Kaliumchlorid (KCl, ≥ 99). ,7 %, CAS 7447-40-7, Sigma-Aldrich), Dikaliumhydrogenphosphat-Trihydrat (K2HPO4.3H20, ≥ 99 %, CAS 16788-57-1, Sigma-Aldrich) Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2.6H2O, ≥ 99 %, CAS 7791-18-6, Sigma-Aldrich), Calciumchlorid (CaCl2, ≥ 97 %, CAS 10043-52-4, Sigma-Aldrich), Natriumsulfat (Na2SO4, ≥ 99,0 %, CAS 7757-82 -6, Sigma-Aldrich), Tris-hydroxymethylaminomethan ((HOCH2)3CNH2) (tris), ≥ 99,8 %, CAS 1185-53-1, Sigma-Aldrich), Salzsäure (HCl, 36 % CAS 7647-01- 0, Sigma-Aldrich), Bacillus licheniformis (Alkalase, CAS 126741 Sigma-Aldrich), L-Cystein (CAS,52-90-4), Azidnatrium (CAS 26628-22-8, Sigma-Aldrich), TRIS-Puffer pH 9,0 (CAS 77-86-1, Alfa Aesar), Dimethylsulfoxid (DMSO, CAS 23486.297; BDH Prolab), Dulbecco's Modified Eagle Medium α (DMEM/F12, CAS 10565018; Gibco)), 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT, 98 %, CAS 298- 93-1, Sigma-Aldrich), fötales Rinderserum (FBS, CVFSVF00-01; Eurobio), Trypsin-EDTA (CAS 25300-054; Gibco), Hexamethyldisilazan (CAS 999-97-3, Sigma-Aldrich) wurden erhalten und ohne weitere Reinigung verwendet werden. Die von ATCC erhaltene hFOB-Osteoblastenzelllinie wurde für die Zytokompatibilitätsanalyse verwendet.

Cellulose-Nanokristalle (CNC) wurden aus Ficus thonningii (FT) durch ein dreistufiges Verfahren synthetisiert, das auf (1) Alkalibehandlung, (2) Bleichen und (3) Säurehydrolyse basiert, wie von Dingyuan Zheng78 mit Modifikationen vorgeschlagen. Kurz gesagt, FT-Rohfasern, die zuvor getrocknet und bei 70 °C gelagert wurden, wurden geschnitten, zerkleinert und dann in einer alkalischen Lösung von Natriumhydroxid (NaOH, 0,5 N) mit einem Verhältnis von FTFs/NaOH-Fasern zu Lösung von 3 g/80 ml dispergiert. Sie wurden 4 Stunden lang kontinuierlich bei 100 °C gerührt. Nach der Alkalibehandlung wurden die Fasern filtriert und mit 18 M MilliQ-Wasser bis zur pH-Neutralisierung gewaschen. Die resultierenden Fasern wurden mit Wasserstoffperoxid (H2O2) 1 Stunde lang bei 80 °C gebleicht. Der Bleichvorgang wurde mehrmals wiederholt, um strahlend weiße Fasern zu erhalten. Schließlich wurde die Nanozellulosesynthese durch den Säurehydrolyseprozess und anschließende Ultraschallbeschallung durchgeführt. Im Einzelnen wurden 10 g gebleichte Fasern in 200 g einer wässrigen Schwefelsäurelösung (64 %) unter Magnetrührung für 1 Stunde und 30 Minuten bei 45 °C gelöst. Anschließend wurde die erhaltene Suspension filtriert, mehrmals mit 18 M MilliQ-Wasser gewaschen und anschließend 7 Tage lang einer Dialyse unterzogen (in Dialysebeuteln von 12.000 bis 14.000 Da). Nach der Dialyse wurde die resultierende Lösung in einem Eisbad mit einem Ultraschallhomogenisator (BANDELIN electronic, GM 3100) beschallt, der mit einer 7-cm-Sondenspitze ausgestattet war. Der Arbeitsbereich des Ultraschallhomogenisators wurde auf 50 % eingestellt. Die resultierende Suspension wurde 30 Minuten lang bei 10.000 U/min zentrifugiert und die Paste wurde gefroren, lyophilisiert und dann mit einem Moulinex-Mischer (LM935) 3 Minuten lang bei 8.000 U/min gemahlen, um ein weißes Pulver aus Cellulose-Nanokristallen (CNC) zu erhalten. Abbildung S5 fasst die Schritte der Cellulose-Nanokristallsynthese aus FT-Stamm zusammen (siehe ergänzende Informationen).

Um homogene PLA/CNC-Verbundfilamente durch Einschneckenextrusion herzustellen, schlugen wir zunächst vor, Verbundwerkstoffe zu formulieren, indem Nanozellulosefüllstoffe durch chemische Auflösung in die PLA-Matrix eingebaut werden. 30 g PLA wurden in 200 ml Dichlormethan (DCM) bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem magnetischem Rühren gelöst, gefolgt von einer Ultraschallbehandlung in einem Eisbad für 5 Minuten. Dann wurde die CNC/DCM-Suspension zu der PLA-Suspension hinzugefügt, um Mischungsaufschlämmungen aus PLA/CNC/DCM mit 0, 1, 3 und 5 % (Gew./Gew.) CNC im Verhältnis zu PLA zu ergeben (Tabelle 3). Die erhaltenen PLA/CNC/DCM-Suspensionen wurden in einem Eisbad mit einem Ultraschallhomogenisator 15 Minuten lang beschallt und 24 Stunden lang unter kontinuierlichem magnetischem Rühren bei Raumtemperatur gehalten, um eine gute Homogenisierung sicherzustellen. Anschließend ließ man sie über Nacht bei Raumtemperatur trocknen, schnitt sie dann in kleine Stücke und trocknete sie 24 Stunden lang unter Vakuum, um eine vollständige Trocknung sicherzustellen. Die resultierenden getrockneten Verbundpolymere wurden mit einem Noztek-Einschneckenextruder Modell MHB26234 bei einem Temperaturbereich von 160–165 °C extrudiert. Anschließend wurden sie durch Umwandlung am Düsenauslass mit dem Extrudergebläse abgekühlt, um PLA/CNC-Hybridfilamente mit der Bezeichnung PLA/CNCx zu ergeben, wobei x dem CNC-Gehalt entspricht. Schließlich wurden Filamente mit einem Durchmesser von ca. 1,75 ± 0,05 mm für den 3D-Druck ausgewählt. Die reinen PLA-Filamente wurden durch direkte Extrusion aus PLA-Schaufeln unter den gleichen Bedingungen wie die Verbundfilamente hergestellt. Abbildung 8 fasst die Herstellung von PLA/CNC-Verbundfilamenten zusammen. Die Extrusionssequenz wurde zwei- bis dreimal wiederholt, um PLA/CNCx-Filamente mit homogenen Durchmessern zu erhalten. Das Gerüst wurde durch Computer Aided Design (CAD) mit der Design Spark Mechanical-Software modelliert, in eine STL-Datei übersetzt und mit der Prusa3Dslicer-Software in Scheiben geschnitten, um den G-Code zu generieren. Schließlich wurden die zylindrischen Designs (porös) (Durchmesser (10 mm) × Höhe (2 mm)) und die rechteckigen Stücke (dicht) mit einem FDM Prusa MK2S Research-Modelldrucker entworfen, der mit einer Düse von 0,4 mm Durchmesser bei 200 ausgestattet war °C. Die Filamente wurden mit einer geraden Füllarchitektur in präzisen Richtungen von 0° und 90° zwischen zwei aufeinanderfolgenden Schichten abgelegt. Die Dicke jeder Schicht betrug 0,15 mm mit 80 % Füllung für die Zylinder und 100 % Füllung für die rechteckigen Stücke und die Druckgeschwindigkeit betrug 30 mm/s.

Herstellungsschritte des PLA/CNCx-Gerüsts (Extrusion des Verbundfilaments und 3D-Druck).

PLA- und PLA/CNCx-Verbundwerkstoffe wurden mit einem Differentialscanningkalorimeter (DSC) (Q20, TA-Instrumente) untersucht, das mit einem RCS90-Kühlsystem (TA-Instrumente) ausgestattet war. Die Proben wurden in einer Aluminium-TA-Pfanne eingewogen und verschlossen. Als Referenz diente eine leere, versiegelte Pfanne. Die Proben wurden zunächst auf 25 °C abgekühlt und dann unter Stickstoffatmosphäre mit einer Heizrate von 20 °C min−1 auf 250 °C erhitzt. Die thermischen Eigenschaften von PLA- und PLA/CNCx-Verbundwerkstoffen wie die Glasübergangstemperatur (Tg), die Kaltkristallisationstemperatur (Tcc), die Schmelztemperatur (Tm) und die Schmelzenthalpie (ΔHm) wurden durch die Erwärmungsscans bewertet. Der Kristallinitätsgrad (\({\chi }_{c}\)) wurde sowohl für den Kaltkristallisationspeak als auch für den Schmelzpeak mithilfe der folgenden Gleichungen56 bestimmt:

Dabei ist ΔHcc die Enthalpie der Kaltkristallisation, W der Gewichtsanteil von PLA in der Probe und ΔHm0 die Schmelzenthalpie für 100 % kristallines PLA-Material, die mit 93 J g−1 angenommen wurde. Die thermogravimetrische Analyse (TGA) wurde mit einem TGA Q500-Gerät (TA Instruments) durchgeführt. 10 mg jeder Probe wurden unter Stickstoff mit einer Heizrate von 10 °C min−1 von Raumtemperatur auf 800 °C erhitzt.

Die Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR) wurde in einem abgeschwächten Totalreflexionsmodus (ATR-FTIR) auf einem NICOLET NEXUS-Modellspektrometer durchgeführt. Alle Spektren wurden in einem Spektralbereich von 4000–650 cm−1 mit einer Akkumulation von 32 Scans bei einer Auflösung von 4 cm−1 aufgenommen.

Die Morphologie von CNC-, extrudierten PLA- und Verbundfilamenten sowie 3D-gedruckten Gerüsten wurde mithilfe der Rasterelektronenmikroskopie HITACHI S4800 beobachtet. Die Proben wurden 30 s lang mit Platin sputterbeschichtet, wobei ein Polaron SC7620 Mini Sputter Coater für die SEM-Analyse verwendet wurde. Mit der Image J-Software wurde der mittlere Filamentdurchmesser durch Mittelung an 20 Punkten und die Porengröße durch Mittelung von 8 Poren berechnet, was als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben wird. Die Topographie der Gerüstoberflächen wurde mithilfe optischer 3D-Mikroskopie (Keyence) und eines konfokalen chromatischen Rauheitstesters (STIL SA), ausgestattet mit einem CHR1000-Sensor, analysiert.

Die Porosität des Gerüsts wurde durch eine Flüssigkeitsverdrängungsmethode ermittelt, wie in der Literatur beschrieben64. Kurz gesagt wurden die Gerüste 30 Minuten lang in Röhrchen getaucht, die eine bestimmte Menge Ethanol (W1) enthielten. Anschließend wurde das Gesamtgewicht der eingetauchten Gerüste und des Ethanols als W2 notiert. Nach dem Entfernen der Gerüste wurde der restliche Ethanolgehalt in den Röhrchen als W3 notiert. Die Porosität der Gerüste wurde nach folgender Gleichung gemessen:

Die mechanischen Eigenschaften von 3D-gedruckten PLA/CNC-Gerüsten wurden mithilfe eines Zugsystems (Zwick Roell) in Verbindung mit einer 5KN-Lastzelle charakterisiert. Die Proben wurden in Form eines Hundeknochens (40 mm lang, 4 mm breit und 1,5 mm dick) gedruckt. Die Proben wurden dann zwischen speziellen Backen eingespannt und mit einer Geschwindigkeit von 0,05 mm s−1 gezogen, bis sie brachen. Die Software von Zwick Roell ist in der Lage, Elastizitätsmodul, maximale Bruchkraft und Bruchdehnung zu berechnen. Um eine statistische Messung durchzuführen, werden mindestens 5 Exemplare unter den gleichen Bedingungen gedruckt.

Der Kontaktwinkel der 3D-gedruckten Gerüste mit Wasser wurde untersucht, um ihre Hydrophilie bei Raumtemperatur mithilfe der Sessile-Drop-Methode zu bestimmen. Es wurden zwei Gerüste analysiert: PLA als Referenz und PLA/CNC3 als Verbundwerkstoff mit der besten mechanischen Leistung. Die Tropfen wurden mit einem Tropfenformanalysator – DSA25, ausgestattet mit einer Monochromkamera B-CAM-21-BW (CCCIR) und einer R60-LED-Lampe (Conrad) fotografiert. Kurz gesagt wurden 6 μl 18 M MilliQ-Wasser auf die Oberfläche jedes Gerüsts getropft und der Kontaktwinkel im Gleichgewicht (berücksichtigt bei 60 s) aufgezeichnet. Zur Berechnung der Kontaktwinkel wurden One Touch Grabber und Image J-Software verwendet. Das Quellverhalten der Gerüste wurde gravimetrisch bestimmt. Gerüste mit zuvor bekanntem Gewicht (Wd) werden in 10 ml 18 M MilliQ-Wasser getaucht und dann unter kontinuierlichem Rühren bei 37 °C für eine Gleichgewichtszeit von schätzungsweise 7 Tagen inkubiert. Anschließend wurden die Proben aus dem Wasser genommen, mit Filterpapier gereinigt, um überschüssiges, an der Oberfläche adsorbiertes Restwasser zu entfernen, und gewogen (Wh). Abschließend wurde der Gerüstquellungsindex wie folgt bestimmt:

Der enzymatische Abbau von PLA und PLA/CNC3 wurde unter Verwendung des Enzyms Alcalase gemäß einem zuvor in der Literatur beschriebenen Protokoll mit Modifikationen durchgeführt29,79,80. Tatsächlich wurden Streifen aus PLA- und PLA/CNC3-Gewebe (Abmessungen 5 [B] × 15 [l] × 0,13 [h]) von etwa 0,25 g gedruckt und in 25 ml TRIS-Puffer (pH 9,5, 60 °C) eingetaucht eine optimale Konzentration von 50 % (w/w) (bezogen auf das Gewicht des Gewebes) der für die enzymatische Hydrolyse erforderlichen Alcalase, 3 mM L-Cystein und 0,05 % (w/w) Azidnatrium (bezogen auf das Gewicht des Gewebes). TRIS-Puffer). Der Abbau wurde durch Bestimmung des Gewichtsverlusts nach 4, 7, 14, 21 und 28 Tagen beurteilt. Die Proben wurden zunächst 90 Minuten lang bei 105 °C getrocknet, in einem Exsikkator abgekühlt und dann in einer geschlossenen Wägeflasche gewogen. Der prozentuale Gewichtsverlust wurde wie folgt berechnet:

wobei W1 und W2 das Trockengewicht der Proben vor bzw. nach dem biologischen Abbau sind.

Die osteoblastische Zelllinie hFOB 1.19 (ATCC® CRL11372™, ATCC, USA)77 wurde unter Verwendung von DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium α) (Gibco 10565018) konditionierten Medien, ergänzt mit 10 % (V/V) fötalem Rinderserum (FBS), kultiviert ) (Eurobio CVFSVF00-01). Die Zellen wurden bei 37 °C in 5 % CO2 in einer Petrischale mit 10 cm Durchmesser kultiviert und mit 0,05 % Trypsin-EDTA (Gibco 25300-054) trypsinisiert. Nach 30-minütiger Sterilisation mit 70 % (w/v) Ethanol und einstündiger UV-Bestrahlung wurden die Filamente und gedruckten Gerüste bei Raumtemperatur getrocknet und dann 5 Tage lang mit hFOB-Zellen in Kontakt gebracht.

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mithilfe eines MTT-Assays analysiert, der durch 3-stündiges Inkubieren von 100 µL einer 0,5 mg/ml MTT-Lösung auf den Zellen durchgeführt wurde. Lila gefärbte Formazankristalle wurden mit 100 µL DMSO (BDH Prolab 23486.297) gelöst und die Absorption bei 560 nm mit einem Multiskan Plat Reader (Thermos, USA) aufgezeichnet.

Für Adhäsionstests wurden hFOB 1.19-Zellen 4 Tage lang auf den Gerüsten kultiviert (Aussaat von 2 × 104 Zellen pro Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen, die das Gerüst enthielt). Auf Gerüsten kultivierte Zellen wurden mit 2,5 %iger Glutaraldehydlösung 2 Stunden lang bei Raumtemperatur fixiert. Gerüste mit Zellen wurden dann zweimal 15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Verwendung steigender Ethanolkonzentrationen (30 %, 50 %, 70 %, 95 % (v/v)) inkubiert, gefolgt von absolutem Ethanol und dann Hexamethyldisilazan über Nacht. Für Gerüstwachstumstests wurden Luciferase-exprimierende hFOB 1.19-Zellen 6 Tage lang auf Gerüsten kultiviert (Aussaat von 2 × 104 Zellen pro Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen, die das Gerüst enthielt). Die Luciferase-Aktivität wurde nach der Zelllyse mit einem Luminometer quantifiziert. Um nur den Einfluss von Cellulose auf die biologischen Eigenschaften von PLA zu untersuchen, wurde ein 2D-Modell verwendet.

hFOB 1.19-Zellen wurden mit 500.000 Zellen/Well in 6-Well-Flachbodenplatten ausgesät und 48 Stunden lang bei 37 °C/5 % CO2 in 2 ml Medium inkubiert, das zuvor 24 Stunden lang mit den entsprechenden Gerüsten bei 0,2 g/L inkubiert worden war. ml. Die Gesamt-RNA wurde mit dem EZNA Total RNA Kit I gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die cDNA wurde aus 1 µg RNA durch Reverse Transkriptase (Mix qScript, Invitrogen Life Technologies) synthetisiert. PCR-Reaktionen wurden in einem Thermocycler (LightCycler® 480) über 30 Zyklen durchgeführt. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Zur Beurteilung der Knochenbioaktivität wurde die Fähigkeit zur Bildung von Apatit auf PLA- und PLA/CNC3-Gerüsten durch mineralisierte Kultur in vitro in simulierter Körperflüssigkeit (SBF) gemäß der in der Literatur beschriebenen Methode81 untersucht. Kurz gesagt, die Gerüste wurden in 10 ml frisches SBF eingetaucht und dann in einem thermoplastischen Inkubationsschüttler bei 37 °C inkubiert. Die SBF-Lösung wurde während des vierwöchigen Studienzeitraums jeden zweiten Tag gewechselt. Nach der Inkubation wurden wöchentlich Proben aus der Flüssigkeit entnommen und in einem Exsikkator getrocknet. Abschließend wurden Rasterelektronenmikroskopie (REM) und energiedispersive Röntgenspektroskopie (Detektor: Oxford Instruments X-Max AZTEC, UK; Mikroskopie: Zeiss EVO HD15, Deutschland) durchgeführt, um den Mineralisierungsgrad der Gerüste zu untersuchen.

Bei den meisten quantitativen Charakterisierungsmethoden wurde der ANOVA-Test verwendet, um zu bewerten, ob die Daten aus jeder Probengruppe einen signifikanten Unterschied aufwiesen (p < 0,05 für signifikant). Für den Abbautest wurde ein ungepaarter t-Test durchgeführt, um Daten von PLA mit PLA/CNC3 zu vergleichen. Für die biologischen Tests wurde zur statistischen Analyse der Mann-Whitney-Test durchgeführt.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten.

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Hélène Garay wird für ihre Unterstützung bei Topographieanalysen gewürdigt.

Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Hochschulbildung und wissenschaftliche Forschung (MESRS) der Republik Côte d'Ivoire, der französischen Nationalagentur (ANR, JCJC-Programm, MONOME ANR-20-CE08-0009) und dem IEM Ax Energy-Projekt PAT finanziert (Festes CeraLique).

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Habib Belaid, Marilyn Kajdan und Vincent Cavaillès

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Korrespondenz mit Chrystelle Salameh.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

N'Gatta, KM, Belaid, H., El Hayek, J. et al. 3D-Druck von Verbundwerkstoffen auf Basis von Cellulose-Nanokristallen zum Aufbau robuster biomimetischer Gerüste für die Knochengewebetechnik. Sci Rep 12, 21244 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25652-x

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Eingegangen: 13. Juni 2022

Angenommen: 02. Dezember 2022

Veröffentlicht: 08. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25652-x

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